Перестройки гена ALK при немелкоклеточном раке легких  

И.А. Демидова

Московская городская онкологическая больница №62, лаборатория молекулярной биологии, Москва

 

Роль транслокаций – перемещений генетического материала между генами, ведущих к формированию химерных структур – в онкогенезе известна достаточно давно. Из 384 генов, являющихся доказанными участниками опухолевой трансформации, по данным Сангеровского Института, как минимум 282 участвуют в реарранжировках при самых разнообразных опухолях. [1]. Надо отметить, что в течение длительного времени транслокации считались более характерными для опухолей кроветворной системы и сарком, чем для новообразований эпителиоидной природы. В первую очередь, это было связано с ограниченными возможностями существовавших цитогенетических методик. В последние годы применение современных генетических методов  доказало, что хромосомные перестройки не только являются нередким событием при солидных опухолях, но и зачастую играют ведущую роль в их развитии и прогрессии. [2;3].

 

Обнаружение внутрихромосомной перестройки короткого плеча 2 хромосомы, ведущее к образованию химерного онкогена EML4/ALK при немелкоклеточном раке легких (НМРЛ) стало одним из важнейших шагов в дальнейшей расшифровке генома этого заболевания и расширении возможностей персонализации его лечения. Исследования Soda  и соавт., опубликованные в 2007 году в журнале Nature, показали ведущую роль этого генетического нарушения в онкогенезе для небольшой подгруппы аденокарцином  легких  и предположили возможность блокирования химерного протеина с помощью ингибиторов тирозинкиназ. [4].  

 

Функции ALK в норме и при развитии злокачественных опухолей.

ALK является рецепторной тирозинкиназой из семейства инсулинзависимых рецепторов с весьма специфическими локализацией и типом экспрессии. В норме протеин ALK активно экспрессируется в нервной ткани только во время эмбриогенеза, регулируя пролиферацию нейронов. [5].  Небольшие количества мРНК ALK выявляются в тканях мозга, кишечника и простаты и  во взрослом возрасте, однако, экспрессия протеина крайне низка. Как и у любой тирозинкиназы, основной функцией этого рецептора является передача сигнала, полученного от своего химического вещества-стимулятора, или лиганда (плейотропина и мидкина), в клетку. [6]. Интересно, что основными сигнальными путями, задействованными в передаче, являются пути PI3K/ERK и RAS/MAPK, то есть те же, что участвуют в передаче сигнала  EGFR (рис 1). [7;8]. Лиганды ALK также высоко экспрессируются только во время эмбрионального развития, поэтому во взрослом организме этот рецептор практически не функционирует .[9].

 

Активация ALK при его перестройках возникают в результате образования химерных генов, в которых участвует тирозинкиназный домен ALK и регулирующие последовательности других генов-партнеров, сохраняющих активность во все периоды жизнедеятельности организма. В такой ситуации ALK попадает под воздействие второго участника транслокации, становится независимым от своих лигандов и передает сигнал постоянно, нарушая нормальную дифференцировку и апоптоз клетки. [10]. Так происходит при всех опухолях, в генезе которых принимает участие перестроенный ген: при анапластической Т-клеточной лимфоме, воспалительной миофибробластической опухоли, некоторых опухолях нервной системы, редких случаях  плоскоклеточного рака пищевода и т.д. [11]. При НМРЛ наиболее часто выявляется химерный ген EML4/ALK. Его образование происходит в результате делеции, возникающей в коротком плече 2 хромосомы и поворота 5’ части ближайшего соседа ALK, гена EML4, вокруг своей оси.[4] Таким образом, ALK попадает под влияние регулирующих последовательностей EML4 (рис 2) и переходит в активное состояние. Как правило, в формировании транскрипта химерного гена участвует 20 (редко – 19) экзон ALK. Точка разрыва EML4 гораздо разнообразнее – описано как минимум 11 видов химерного транскрипта в зависимости от экзона этого гена, принимающего участие в его формировании. [12]. Доказано, что все виды EML4/ALK обладают одинаково выраженным онкогенным потенциалом, однако, чувствительность различных видов химерного протеина к блокаторам тирозинкиназ может быть различной. Такие данные были получены при исследованиях in vitro, подтверждения этому in vivo пока нет [13]. Известны также другие гены-партнеры ALK: KIF5B, TGF, KLC1. Частота таких транслокаций невелика и составляет не более 10% (рис 3).

 

Одним из путей блокирования активированных тирозикиназ является использование  малых молекул-ингибиторов, структура которых подбирается таким образом, чтобы как можно эффективнее заблокировать ту часть протеина, которая участвует в связывании энергетической молекулы и прекратить передачу сигнала. [14]. Таким образом работают ингибиторы химерного протеина BCR-ABL при хроническом миелолейкозе и мутантного EGFR при НМРЛ. При перестройках гена ALK высокую эффективность показал кризотиниб, который разрабатывался как сочетанный блокатор MET и ALK. Уже в экспериментах in vitro было обнаружено, что минимальные ингибирующие концентрации препарата, вызывающие апоптоз клеток, экспрессирующих EML4/ALK, очень низки, что позволило быстро перейти от доклинических испытаний к клиническим и подтвердить его выраженное противоопухолевое действие (рис 4). [4]. Исследование I фазы в группе из 119 больных показало, что количество объективных ответов (полные и частичные ремиссии) составило 61% (95 % ДИ, 52–70 %), клинический эффект (полные, частичные ремиссии и стабилизация) был достигнут у 88 %, а предварительная медиана выживаемости без прогрессии достигала 10 месяцев (95 % CI, 8–15 месяцев). [15]. Полученные данные были подтверждены и предварительными данными продолжающегося исследования II фазы. Из 136 больных, включенных в исследование (планируется включить 400) объективный ответ был получен у 51%, а медиана выживаемости еще не достигнута. [16]. Эти данные представляются еще более впечатляющими, если сравнить их с результатами стандартной химиотерапии второй линии у пациентов с НМРЛ, в результате которой объективный ответ на лечение достигается у 10% больных, а выживаемость без прогрессии не превышает 3 месяцев. [17.;18]. Полученные результаты позволили провести процедуру быстрой регистрации препарата для клинического использования в Федеральном управлении по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) не дожидаясь результатов III фазы исследований. [19].   

 

Демогрфические и клинико-лабораторные характеристики пациентов с перестройкой гена ALK

Таким образом, выявление пациентов с НМРЛ, ассоциированным с транслокациями гена ALK, приобретает особую важность. Однозначных критериев, которые позволили бы совершенно точно определить группу больных, для которых характерно присутствие этой генетической аберрации пока не существует. Количество выявленных случаев относительно невелико, недостаток клинической информации и разночтения в критериях диагностики не всегда позволяют провести адекватный статистический анализ. Однако уже известен ряд признаков, ассоциирующихся, по данным ранее проведенных исследований, с высокой частотой встречаемости перестроек гена ALK. В первую очередь, имеет значение гистологическая форма опухоли. Практически все случаи реарранжировки гена ALK обнаружены у больных с аденокарциномой, хотя встречаются единичные сообщения о выявлении перестроек в опухолях с гистологическими признаками плоскоклеточного рака. [20]. Более чем в 50% рарранжированных случаев обнаруживается преимущественно солидная или ацинарная структура опухоли, гораздо реже – чешуйчатая и крайне редко - муцинозная форма аденокарциномы. В 70-75% случаев  выявляется присутствие перстневидных клеток (рис 5). [21]. В целом, частота встречаемости перестроек ALK при всех формах аденокарцином составляет от  3 до 14% в зависимости от особенностей выборки. [22] Такие существенные различия связаны, в первую очередь, со следующим важным фактором, влияющим на частоту встречаемости транслокаций ALK при НМРЛ – курением. Около 56% реарранжировок встречается у некурящих пациентов с НМРЛ. [23]. Согласно опубликованным данным, частота выявления перестроек ALK у некурящих больных НМРЛ составляет от 13,7 до 20%.... [24; 25]. Другими факторами, влияющими на частоту встречаемости этого генетического нарушения, являются молодой возраст больных и отсутствие конкурентных генетических нарушений, таких как мутации генов EGFR и KRAS. Селекция выборки по всем упомянутым критериям позволяет увеличить возможность выявления транслокаций ALK до 45%, однако, ценой такой селекции будет потеря почти 50% позитивных случаев, которые попадут в  исключенные из исследования группы.[26]. В связи с этим общепринятым подходом к выбору пациентов, направляемых на определение перестроек гена ALK, является отбор больных с гистологически доказанной аденокарциномой. Правомерность такого подхода подтверждается не только  результатами клинических исследований, но и фармакоэкономическими расчетами. [24].  

 

Методы, используемые для обнаружения реарранжировок ALK

Общепризнанным методом выявления перестроек гена ALK является флюоресцентная гибридизация in situ (FISH). Наиболее широко используется рекомендованная FDA методика с использованием пробы LSI ALK Break Apart Rearrangement Probe (Abbott Molecular, США) [19]. Проба представляет собой два флюоресцентных зонда, конъюгированных с красителями разного цвета (оранжевым и зеленым) и комплементарных расположенным рядом последовательностям гена ALK. В норме обе пробы гибридизуются рядом и при просмотре в флюоресцентный микроскоп формируют сигнал желтого цвета или видны как расположенные вплотную два сигнала красного и зеленого цвета. При перестройке гена и перемещении одной из его последовательности, сигналы расходятся и видны как лежащие раздельно (рис 6). Такая методика позволяет распознать все виды перестроек гена ALK  вне зависимости от второго партнера транслокации, что и является ее основным преимуществом. Недостатками метода являются его существенная дороговизна и достаточно высокие требования к качеству образца и количеству опухолевых клеток в нем, поскольку для получения достоверного результата необходимо просмотреть не менее 100 ядер. Тем не менее, в США назначение кризотиниба невозможно без подтверждения транслокации методом FISH с использованием пробы Abbott.

 

Другим, также теоретически универсальным методом является иммуногистохимическое исследование (ИГХ), позволяющее выявить высокую экспрессию химерного протеина в цитоплазме опухолевых клеток (рис 7). Метод знаком подавляющему большинству патологов, может быть быстро внедрен в практику и достаточно недорог. Однако коммерчески доступные антитела, разработанные для диагностики анапластической лимфомы, распознают не все конформационные формы протеина, возникающего в результате перестроек гена ALK при НМРЛ. Кроме того, экспрессия химерных протеинов при НМРЛ в ряде случаев достаточно слаба, а сам белок нестоек. [27;13]. Тем не менее, в последнее время достигнуты существенные успехи в усовершенствовании методики – разработан новый клон антител (D5F3, Cell Signalling), появились новые системы детекции с возможностми значительного усиления сигнала.  [28; 29]. Применение новых реагентов позволяет добиться практически 100% чувствительности в выявлении случаев с перестройкой гена ALK.

 

Третьим методом, используемым в диагностике реарранжировок ALK, является обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР). Метод обладает высочайшей чувствительностью, позволяет работать с образцами, содержащими крайне низкое количество опухолевых клеток, способен сразу идентифицировать тип перестройки (рис 8). Тем не менее, ОТ-ПЦР обладает несколькими весьма существенными недостатками. Во-первых, метод очень требователен к качеству РНК, выделенной из образца, в особенности – из фиксированного в формалине и залитого в парафин. Во-вторых, с помощью ОТ-ПЦР возможно выявить только те типы перестройки гена ALK, к которым подобраны специфические праймеры, что требует мультиплицирования исследования и существенных временных затрат.

 

Существует два принципиально различающихся алгоритма обследования, направленные на выявление пациентов с перестройками гена ALK. Первый предполагает после установления диагноза аденокарциномы легких определение мутаций генов EGFR и KRAS в образцах опухоли. Образцы без мутаций в указанных генах направляются на тестирование транслокаций ALK методом FISH. [30]. Такой подход позволяет уменьшить группу обследуемых больных с помощью исключения пациентов с альтернативными мутациями, повысить шанс выявления перестроек ALK и уменьшить общую стоимость тестирования. Однако этот алгоритм связан с существенным неудобством в тех случаях, когда исследования с использованием ПЦР и FISH проводятся в разных лабораториях. В ряде случаев проблемы возникают и при исследовании микробиоптатов, когда образец, приходящий для проведения FISH содержит крайне мало опухолевых клеток и непригоден для проведения анализа.

 

Другой алгоритм предполагает одновременное тестирование образцов аденокарциномы на мутации генов EGFR и перестройки гена ALK. С целью удешевления обследования первым этапом проводится ИГХ-исследование для выявления экспрессии химерного протеина и ПЦР для выявления мутаций EGFR. Далее все ИГХ-позитивные образцы направляются для проведения анализа методом FISH. [27]. Подобный подход позволяет существенно снизить расходы и упростить логистику, и, в случае использования усовершенствованных методик ИГХ, представляется наиболее удобным для ежедневной практики.

 

Использование метода ОТ-ПЦР для проведения широкого скрининга не совсем целесообразно в связи с ограничениями метода, о которых упоминалось выше. Тем не менее, метод имеет свои точки приложения в диагностике перестроек ALK. Во-первых, это исследование биологических жидкостей (плеврального выпота, бронхоальвеолярного лаважа), содержащего крайне мало опухолевых клеток и непригодного для исследования методом FISH. [31]. И, во-вторых, это идентификация вариантов химерного транскрипта, что, возможно, будет востребовано в будущем, если будет доказана дифференциальная чувствительность разных типов реарранжировок к терапии таргетными препаратами.

 

Исследования генетической структуры злокачественных опухолей с целью поиска аберраций, потенциально чувствительных к терапии таргетными препаратами, продолжают интенсивно развиваться. Конечной целью этих исследований в будущем является определение индивидуального генетического портрета каждой опухоли и подбор индивидуального сочетания лечебных воздействий для каждого пациента. Выявление группы больных НМРЛ с перестройками гена ALK позволяет уже сейчас приблизиться к персонализации лечения, существенно увеличив эффективность терапии для этой, ранее практически некурабельной категории пациентов.

 

Список литературы

1.     Mittelman F, Johanson B, Mertens F. The impact jn translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer 2007; 7:233-45

2.     Meyerson M, Gabriel S, Getz G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 2010 Oct;11(10):685-96

3.     Garnett MJ, Edelman EJ, Heidorn SJ et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 2012 Mar 28;483(7391):570-5

4.     Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature. 2007;448(7153):561–566

5.     Iwahara, T., Fujimoto, J., Wen, D et al. (1997) Molecular characterization of ALK, a receptor tyrosine kinase expressed speci?cally in the nervous system. Oncogene 14, 439–449

6.     Stoica, G. E., Kuo, A., Aigner, A., et al. Identi?cation of anaplastic lymphoma kinase as a receptor for the growth factor pleiotrophin. J. Biol. Chem.2001; 276:16772–16779

7.     Bai, R. Y., Ouyang, T., Miething, C et al. Nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase associated with anaplastic large-cell lymphoma activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt antiapoptotic signaling pathway. Blood 2000 

8.     96:4319–4327; Marzec, M., Kasprzycka, M., Liu, X. et al. Oncogenic tyrosine kinase NPM/ALK induces activation of the rapamycin-sensitive mTOR signaling pathway. Oncogene 2007; 26:5606–5614

9.     Kadomatsu, K. and Muramatsu, T. (2004) Midkine and pleiotrophin in neural development and cancer. Cancer Lett. 204, 127–143

10.  Medves S, Demoulin JB. Tyrosine kinase gene fusions in cancer: translating mechanisms into targeted therapiesJ. Cell. Mol. Med. 2012 ;16 (2): 237-248

11.  Palmer RH, Vernersson E, Grabbe C, Hallberg B. Anaplastic lymphoma kinase: signalling in development and disease. Biochem J. 2009; 420(3):345-61

12.  Crystal AS, Show AT. Variants on a Theme: A Biomarker of Crizotinib Response in ALK-Positive Non–Small Cell Lung Cancer? Clin Cancer Res 2012; 18(17):4479-81

13.  Heuckmann JM, Balke-Want H, Malchers, et al. Differential protein stability and ALK inhibitor sensitivity of EML4-ALK fusion variants. Clin Cancer Res 2012;18:4682–90

14.  Traxler P, Furet P. Strategies toward the design of novel and selective protein tyrosine kinase inhibitors. Pharmacol Ther. 1999; 82(2-3):195-206

15.  Camidge DR, Bang Y, Kwak EL, et al. Progression-free survival (PFS) from a phase I study of crizotinib (PF-02341066) in patients with ALK-positive non-small cell lung cancer (NSCLC) [abstract 2501]. J Clin Oncol. 2011;29(suppl):165s

16.  Crino L, Kim D-W, Riely G, et al. Initial phase 2 results with crizotinib in advanced ALK-positive non-small cell lung cancer (NSCLC): PROFILE 1005 [abstract 7514]. J Clin Oncol. 2011;29(suppl):479s

17.  Hanna N, Shepherd FA, Fossella FV, et al. Randomized phase III trial of pemetrexed versus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer previously treated with chemotherapy. J Clin Oncol. 2004;22(9):1589–1597

18.  Shepherd FA, Rodrigues PJ, Ciuleanu T, et al. Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2005;353(2):123–132

19.  Food and Drug Administration (2011) Summary review (application number: 202570Orig1s000). Food and Drug Administration, Silver Spring

20.  An  SJ,  Chen  ZH,  Su  J,  Zhang  XC,  Zhong  WZ,  Yang  JJ,  et  al.  Identi?cation  of  enriched driver  gene  alterations  in  subgroups  of  non-small  cell  lung  cancer  patients  based on  histology  and  smoking  status.  PLoS  ONE  2012;7:e40109

21.   Nishino M, Klepeis V, Yeap B et al. Histologic and cytomorphologic features of ALK-rearranged lung adenocarcinomas. Mod Pathol.2012; 25(11):1462-72

22.  Horn L, Pao W. EML4-ALK: Honing In on a New Target in Non–Small-Cell Lung Cancer J Clin Oncol 2009, 27(26):4232-4235

23.   Weickhardt AJ, Camidge DR. The therapeutic potential of anaplastic lymphoma kinase inhibitors in lung cancer: rationale and clinical evidence. Clin Invest 2011; 1(8): 1119–1126

24.  Atherly A, Camidge R. The cost-effectiveness of screening lung cancer patients for targeted drug sensitivity markers. British Journal of Cancer (2012) 106, 1100 – 1106;

25.  Rodig S, Mino-Kenudson M, Dacic S et al. Unique Clinicopathologic Features Characterize ALK-Rearranged Lung Adenocarcinoma in the Western Population. Clin Cancer Res 2009;15(16): 5216-5223

26.  Kwak EL, Bang YJ, Camidge DR, et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2010;363:1693–1703.

27.  Thunnissen E,   Bubendorf L, Dietel M et al. EML4-ALK testing in non-small cell lung carcinomas of the lung: a review with recommendations.Virchows Arch. 2012 Sep;461(3):245-57

28.  Mino-Kenudson M,. Chirieac L, Law K, et al. A Novel, Highly Sensitive Antibody Allows for the Routine Detection of ALK-Rearranged Lung Adenocarcinomas by Standard Immunohistochemistry Clin Cancer Res 2010;16:1561-1571

29.  Yi  ES,  Boland  JM,  Maleszewski  JJ,  et  al.  Correlation  of  IHC  and  FISH  for  ALK  gene  rearrangement  in  non-small  cell  lung carcinoma:  IHC  score  algorithm  for  FISH.  J  Thorac  Oncol  2011;6:459–65

30.  Garrido P, de Castro J, Coucha A, et al. Guidelines for biomarker testing in advanced non-small-cell lung cancer. A national consensus of the Spanish Society of Medical Oncology (SEOM) and the Spanish Society of Pathology (SEAP). Clin Transl Oncol 2012; 14:338-349

31.  Soda M, Isobe K, Inoue A et al. A Prospective PCR-Based Screening for the EML4-ALK Oncogene in Non-Small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res. 2012; 18(20):5682-5689

 


Последняя новость:

Информируем Вас, что с 07 ноября 2016 года Программа «Совершенствование молекулярно-генетической диагностики в Российской Федерации» расширяется

Читать подробнее